کروماتوگرافی لایه نازک (Thin Layer Chromatography یا TLC) روشی ساده، ارزان و سریع برای جداسازی و شناسایی ترکیبات است. شیمی‌دان‌ها از آن برای بررسی پیشرفت واکنش، کنترل خلوص محصول و انتخاب حلال مناسب برای کروماتوگرافی ستونی استفاده می‌کنند.
اساس روش
در TLC یک لایه‌ی نازک از جاذب (معمولاً سیلیکاژل) روی صفحه‌ای از شیشه، آلومینیوم یا پلاستیک قرار دارد. نمونه به‌صورت یک لکه‌ی کوچک نزدیک پایین صفحه گذاشته می‌شود و صفحه در ظرفی حاوی مقدار کمی حلال (فاز متحرک) قرار می‌گیرد. حلال با خاصیت مویینگی بالا می‌رود و ترکیبات مختلف، بسته به میزان چسبیدن به سیلیکاژل، با سرعت‌های متفاوت حرکت می‌کنند.
- ترکیبات قطبی‌تر محکم‌تر به سیلیکاژل می‌چسبند و کمتر بالا می‌روند.
- ترکیبات کم‌قطبی‌تر سریع‌تر با حلال حرکت می‌کنند.
معنی کدهای روی صفحات TLC
- Silica gel 60: سیلیکاژل با اندازه‌ی منافذ حدود ۶۰ آنگستروم؛ رایج‌ترین جاذب
- F254: حاوی شناساگر فلورسانس. زیر نور UV با طول موج ۲۵۴ نانومتر، صفحه سبز روشن می‌شود و ترکیباتی که UV جذب می‌کنند به‌صورت لکه‌ی تیره دیده می‌شوند.
- G در GF254: یعنی سیلیکاژل حاوی چسب گچ (کلسیم سولفات) است. این نوع پودر برای ساختن صفحات TLC به‌صورت دستی استفاده می‌شود؛ مثل سیلیکاژل ۶۰ GF254.
صفحات آماده‌ی آلومینیومی مثل صفحات TLC سیلیکاژل ۶۰ F254 را می‌توان با قیچی به اندازه‌ی دلخواه برید.
مراحل انجام TLC
- با مداد (نه خودکار) یک خط ملایم حدود ۱ سانتی‌متر بالاتر از لبه‌ی پایین صفحه بکشید.
- نمونه را در حلال فرار حل کنید و با لوله‌ی مویین، لکه‌ای کوچک روی خط بگذارید.
- در ظرف TLC مقدار کمی فاز متحرک بریزید؛ سطح حلال باید پایین‌تر از خط نمونه باشد. یک کاغذ صافی داخل ظرف بگذارید تا فضای ظرف از بخار حلال اشباع شود.
- صفحه را داخل ظرف بگذارید و درِ آن را ببندید.
- وقتی حلال به حدود ۱ سانتی‌متری بالای صفحه رسید، صفحه را خارج کنید و جبهه‌ی حلال را علامت بزنید.
- صفحه را خشک کنید و لکه‌ها را ظاهر کنید.
روش‌های ظاهر کردن لکه‌ها
- نور UV در ۲۵۴ نانومتر: برای صفحات F254؛ سریع و بدون تخریب نمونه
- بخار ید: بسیاری از ترکیبات آلی را قهوه‌ای نشان می‌دهد
- معرف‌های رنگ‌زا: مثل نین‌هیدرین برای آمینواسیدها یا محلول پرمنگنات برای ترکیبات اکسیدشونده، معمولاً همراه با حرارت
محاسبه‌ی Rf
Rf برابر است با فاصله‌ی طی‌شده توسط لکه، تقسیم بر فاصله‌ی طی‌شده توسط حلال:
Rf = 4 cm ÷ 8 cm = 0.5
مثال: اگر حلال ۸ سانتی‌متر و لکه ۴ سانتی‌متر بالا رفته باشد، Rf برابر ۰٫۵ است.
Rf همیشه بین صفر و یک است و فقط در شرایط یکسان (همان نوع صفحه و همان فاز متحرک) قابل مقایسه است. برای شناسایی، بهتر است نمونه و ماده‌ی مرجع را کنار هم روی یک صفحه اجرا کنید.
انتخاب فاز متحرک
- اگر لکه‌ها پایین ماندند، حلال را قطبی‌تر کنید.
- اگر لکه‌ها همراه حلال بالا رفتند، حلال کم‌قطبی‌تری انتخاب کنید.
- مخلوط هگزان و اتیل استات با نسبت‌های مختلف، نقطه‌ی شروع رایجی برای ترکیبات آلی است.
- Rf مناسب برای جداسازی در ستون معمولاً حدود ۰٫۲ تا ۰٫۴ است.
از TLC تا کروماتوگرافی ستونی
TLC کمک می‌کند قبل از کروماتوگرافی ستونی، حلال مناسب را پیدا کنید. برای ستون، سیلیکاژل با دانه‌بندی مناسب استفاده می‌شود؛ مثل سیلیکاژل ۶۰ با دانه‌بندی ۰٫۰۱۵ تا ۰٫۰۴۰ میلی‌متر.
نکات مهم
- لکه‌ی نمونه را کوچک نگه دارید؛ لکه‌ی بزرگ باعث دنباله‌دار شدن می‌شود.
- با دست به سطح صفحه دست نزنید.
- صفحات را در جای خشک نگهداری کنید؛ در صورت جذب رطوبت، چند دقیقه حرارت دادن آن‌ها را فعال می‌کند.
- با حلال‌ها زیر هود کار کنید.
صفحات TLC و انواع سیلیکاژل موجود را در فهرست محصولات ببینید یا برای استعلام با ما تماس بگیرید.